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1,5-二磷酸核酮糖化酶(Rubisco)試劑盒的正確使用方法
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphale carboxylase,RuBPCase)是光合作用碳代謝中的重要的調(diào)節(jié)酶,是植物中最豐富的蛋白質(zhì),主要存在于葉綠體的可溶部分,總量約占葉綠體可溶蛋白50%~60%。本實(shí)驗分別用分光光度法和同位素法測定酶的羧化能力。
二磷酸核酮糖叛化酶(EC 4.1.1.39)是植物光合作用中的一個關(guān)鍵酶,既控制著 CO2的固定,同時又制約著碳素向 Calvin 循環(huán)和光呼吸循環(huán)分流,其活性的大小直接影響著光合速率。測定原理;在 Rubisco 的催化下,1 分子的核酮糖-1,5-二磷酸RuBP)與1分子的 CO, 結(jié)合,產(chǎn)生 2分子的 3-磷酸甘油酸(PGA),PGA 可通過外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用,產(chǎn)生甘油醛-3-磷酸,并使還原型輔酶I(NADH)氧化。因此,340nm 吸光度的變化可計算還原型輔酶 I氧化速率,還原型輔酶I氧化速率可反映 Rubisco 的活性。
自備的儀器和用品:
可見-紫外分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、lmL 石英比色皿、研缽、冰、蒸館水。
四、試劑的組成和配制:
提取液一: 液體 25mLx1 瓶,4C保存:提取液二:液體 25mLx1 瓶,4C保存:
試劑一: 30mLx1 瓶,4C保存:
試劑二: 粉劑x1 瓶,-20C保存,臨用前加入 12.5mL 試劑一,充分混勻備用,用不完的試劑分裝后-20C保存,禁止反復(fù)凍融:試劑三:粉劑x1 瓶,-20C保存,臨用前加入 12.5mL 試劑一,充分混勻備用,用不完的試劑分裝后-20C保存,禁止反復(fù)凍融:試劑四: 粉劑x1 瓶,-20C保存,臨用前加入 1.25mL 試劑一,充分混備用,用不完的試劑分裝后-20保存,禁止反復(fù)凍融;(注意: 試劑二、三、四濟(jì)解后,按需分裝-20C保存。)
五、樣本本處理:
1、總 Rubisco 酶提取:建議稱取約 0.1g 樣本,加入mL 提取液一,冰浴勻漿后超聲破碎 (冰浴,200W.
破碎 3s,間歇 7s,總時間 1min),然后4C,8000g 離心 10min,取上清測定。
胞漿和葉體 Rubisco 的分離: 按照物組織質(zhì)量(g): 提取液體積(mL)為 1:5-10 的比例(建議稱取約 0.1g組織,加入 1mL 提取液一),冰浴勻漿后于 4C,200g 離心5min,分離并保留沉淀,取上清在4C,8000g 下離心 10min,取上清用于測定胞漿 Rubisco 酶活性: 取沉淀加 1mL 提取液二,震蕩溶解后超聲破碎(冰浴,200W,破碎 3s,間歇 7s,總時間1min),然后4C,8000g 離心 10min,取上清測定葉綠體中 Rubisco 酶活性。
建議測定總 Rubisco 活性,按照步1提取液,要分別測定胞和葉綠體中的 Rubisco,則按照步驟2 提取粗液。 (注意:粗酶液制備過程中超聲破碎操作使用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行。)
1,5-二磷酸核酮糖化酶(Rubisco)試劑盒的正確使用方法
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