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使用凝膠層析法分離蛋白質(zhì)
在凝膠層析中常用的凝膠有葡聚糖凝膠(商品名Sephadex)、聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Gel-P)和瓊脂糖凝膠(Agarose)。葡聚糖凝膠是由細(xì)菌葡聚糖(又稱(chēng)右旋糖苷)在糖的長(zhǎng)鏈間用交聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成。在合成時(shí),調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例,可以獲得具有網(wǎng)孔大小不同的凝膠。G值表示交聯(lián)度,G值愈大,交聯(lián)度愈小,網(wǎng)孔和吸水量越大。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)SephadexG50層析柱,以蒸餾水為洗脫劑,分離血紅蛋白(紅色,分子量約64500)與硫酸銅(藍(lán)色,分子量249.5)的混合物,從顏色的不同可觀察到血紅蛋白洗脫快,硫酸銅洗脫較慢。
三.材料
1.儀器 層析柱(直徑0.8-1.5cm,長(zhǎng)10-20cm);吸管;玻璃棒;小燒杯;25ml量筒;試管。
2.試劑 Sephadex G-50;抗凝血; 0.9%NaCI溶液;硫酸銅溶液
四.方法
(一)凝膠的準(zhǔn)備。由準(zhǔn)備室制備。
(二)樣品制備
1.血紅蛋白(Hb)溶液的制備 取抗凝血液約0.5ml于離心管中,離心5分鐘(2500rpm),棄去上層血漿,用0.9%NaCI溶液3ml洗血細(xì)胞二次,將血細(xì)胞用1.5ml蒸餾水稀釋?zhuān)礊镠b稀釋液,備用。
3.取Hb稀釋液與CuSO4溶液各0.5ml,充分混勻,此混合液作為樣品。
(三)裝柱 取層析柱(直徑0.8-1.5cm,長(zhǎng)度20cm)一支,將層析柱燒結(jié)板下端的死區(qū)用蒸餾水充滿,不得留有氣泡,然后關(guān)閉層析柱的出口。將已溶脹的凝膠懸液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中,待底部凝膠沉積1-2cm時(shí),再打開(kāi)出口,繼續(xù)加入凝膠懸液至凝膠層積集至約15cm高度即可。凝膠懸液盡量一次加完,以免出現(xiàn)不均勻或分層的凝膠帶。如表層凝膠凸凹不平時(shí),可用玻棒輕輕攪動(dòng),讓凝膠自然沉降,使表面平整。
(四)加樣與洗脫:加樣時(shí)先將柱的出口打開(kāi),讓蒸餾水逐漸流出,待床面上只留下極薄的一層蒸餾水時(shí),關(guān)閉出口。用滴管將樣品(約0.4ml)小心地加到凝膠床的表面上。注意加樣時(shí)不要將床面沖起,亦不要沿柱壁加入。然后,打開(kāi)出口,使樣品恰好進(jìn)入床面(不要讓空氣進(jìn)入床內(nèi)),用上法滴加1-2倍樣品體積的蒸餾水,待*流進(jìn)床內(nèi)后,再加蒸餾水進(jìn)行擴(kuò)展洗脫,直至兩條區(qū)帶分開(kāi)為止。
注意事項(xiàng):洗脫的過(guò)程中,應(yīng)不斷滴加蒸餾水,使始終凝膠床的上表面保留約2cm左右的蒸餾水
原理
介紹層析的概念
所謂層析,就是利用樣品中各組成成分的理化性質(zhì)的差異,使各組分以不同程度分布在固定相和流動(dòng)相兩相中,由于各組分隨流動(dòng)相前進(jìn)的速率不同,從而把它們分離開(kāi)來(lái)的技術(shù)。這些物理特性包括分子的大小、形狀、所帶電荷、揮發(fā)性、溶解性及吸附性質(zhì)等。層析系統(tǒng)的必要組分有:
a. 固定相,可以是一種固體、凝膠或固定化的液體
b. 層析床,把固定相填入一個(gè)玻璃或金屬柱中,或者薄薄涂布一層于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纖維紙上。
c. 流動(dòng)相,起溶劑作用的液體或氣體
d. 運(yùn)送系統(tǒng),用來(lái)促使流動(dòng)相通過(guò)層析床。
e. 檢測(cè)系統(tǒng),用于檢測(cè)試管中的物質(zhì)。
由于不同物質(zhì)固定相相互作用的強(qiáng)弱不同,從而使得分離目的得以實(shí)現(xiàn)。
要點(diǎn):層析系統(tǒng)中,與固定相作用強(qiáng)的物質(zhì)受到的阻力zui大,而作用弱的物質(zhì)受到的阻力很小,因而不同物質(zhì)在層析過(guò)程中的遷移距離和洗脫時(shí)間不同。
介紹凝膠層析的概念。凝膠層析又稱(chēng)分子篩層析,主要根據(jù)混合物中分子的大小和形狀不同 ,在通過(guò)凝膠時(shí),分子的擴(kuò)散速率各異而達(dá)到分離的目的。凝膠顆粒具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),小分子易進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔,流程長(zhǎng)而移動(dòng)速度慢,而大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔,沿凝膠顆粒間隙流動(dòng),流程短移動(dòng)快。這種現(xiàn)象稱(chēng)為分子篩效應(yīng)。
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