了解PCR儀的技術(shù)種類

1、PCR-SSCP

PCR-SSCP是1989年日本Orita等創(chuàng)建的篩查突變的技術(shù)。它是一種簡單、快速、經(jīng)濟的點突變篩查手段。PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴增后的DNA-片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動速率，相同長度的 DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動帶。



PCR擴增后的DNA-片段經(jīng)變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現(xiàn)泳動帶的變位即可推測存在堿基置換。其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過DNA測序才能確定。因此PCR-SSCP檢測是測序之前突變篩查的常用手段。



為了便于觀察分析結(jié)果，PCR擴增體系中常加入a-32P dNTP標記PCR產(chǎn)物，電泳后放射自顯影觀察泳動帶的位置。目前也常用銀染法來染色聚丙烯酰胺凝膠上的DNA泳動帶，此方法可避免同位素的污染及對操作者的輻射損傷，但其靈敏度不如用同位素標記。單鏈DNA-片段的立體構(gòu)象主要與堿基序列相關(guān)，但也受到其他條件的影響。



因此，PCR-SSCP技術(shù)的關(guān)鍵在于電泳時的諸多條件，如凝膠的組成、電泳的溫度、離子濃度以及影響分子內(nèi)相互作用的其他溶質(zhì)等。PCR-SSCP的缺點是存在假陰性和假陽性，一般對長度不超過300bp的待測片段的檢出率為70~80%。



2、Assembly PCR(也稱作Polymerase Cycling Assembly或PCA)：

組裝PCR通過使用多個具有短重疊區(qū)的長的寡核苷酸來合成長的DNA鏈的方法。通過寡核苷酸產(chǎn)生一條條正向或反向DNA鏈，而寡核苷酸的重疊區(qū)則確定鏈組裝的順序，因此可有選擇性的產(chǎn)生zui終的長鏈DNA分子。



3、Asymmetric PCR：

不對稱PCR，可選擇性的擴增出靶DNA的一條鏈，從而用于測序反應(yīng)或制備單鏈雜交探針。反應(yīng)中限制一個引物的加入量，隨著這一引物的用盡，后續(xù)的擴增中另一引物延伸的產(chǎn)物量大大過量。這一技術(shù)的關(guān)鍵是使用的限制引物的量要合適，引物量過多，則產(chǎn)物主要是雙鏈DNA；引物量過少，在前幾輪循環(huán)就被耗盡，結(jié)果導(dǎo)致單鏈的產(chǎn)量減少。在不對稱PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展出Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR，線性指數(shù)PCR)，使數(shù)量限制的引物比過量的引物的解鏈溫度更高，從而維持較高的反應(yīng)效率。



4、Hot start PCR：

熱啟動PCR，是提高PCR特異性和可信度的zui-好的方法之一。通過阻止溫度升高到變性溫度前的PCR反應(yīng)的發(fā)生而阻止引物與基因組DNA上潛在的高同源性區(qū)域結(jié)合引起的錯誤引發(fā)（mispriming）。同時熱啟動還使引物通過互補區(qū)域堿基配對而擴增產(chǎn)生的引物二聚體量大大降低。

熱啟動PCR可通過三種方式實現(xiàn)：

1)手動熱啟動：配置反應(yīng)液時忽略一種關(guān)鍵成分（聚合酶、Mg離子或dNTP），當反應(yīng)液升溫到80℃以上或變性溫度時再加入。手動熱啟動操作繁瑣，而且因為增加了一次開蓋操作，增加了污染的機會，同時由于管與管間的加樣誤差，可能使平行樣品間擴增結(jié)果產(chǎn)生差異；更簡單的手動熱啟動是在冰上配置反應(yīng)液，待熱蓋升溫到變性溫度，按下擴增儀的暫停鍵，立即將反應(yīng)管放在儀器上開始反應(yīng)，當然這種方法的可信度也zui低

2)將聚合酶用石蠟珠包裹（或在反應(yīng)液上部滴一滴融化的石蠟，待其凝固后，將聚合酶加到石蠟層的上部）使其與反應(yīng)液的其它成分分開，直到反應(yīng)液升溫融化石蠟后，酶才進入反應(yīng)液中；3)使用熱啟動DNA聚合酶，這種酶通過化學(xué)修飾或與抗體結(jié)合，常溫下沒有活性，而只有當反應(yīng)液加熱到變性溫度一段時間后，酶的活性才被釋放。使用熱啟動DNA聚合酶相比手動熱啟動操作簡便，缺點是用熱啟動DNA聚合酶的價格較高。



5、InterSequence-Specific PCR(ISSR-PCR)：

序列間特異性PCR：一種DNA指紋圖譜技術(shù)，所選的引物定位在基因組的片段重復(fù)區(qū)（如Alu族），擴增后產(chǎn)生基于不同產(chǎn)物長度的唯-一的指紋圖譜。



6、Ligation-mediated PCR：

連接介導(dǎo)PCR，首先使用小的寡核苷酸接頭連接靶DNA-片段，然后選擇與接頭結(jié)合的PCR引物來擴增未知的靶片段。這一技術(shù)主要用在DNA測序、染色體步移技術(shù)（genome walking）和DNA指紋圖譜等。



7、Methylation-specific PCR (MSP)：

甲基化特異性的PCR，用于研究基因組CpG島的甲基化模式。首先是用亞硫酸氫鈉處理靶DNA，使未甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物識別成胸腺嘧啶，然后分別用能區(qū)分修飾和非修飾模板的不同的引物來擴增（一對可識別胞嘧啶引物擴增原來甲基化的模板，令一對可識別尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物擴增非甲基化的模板）。結(jié)合定量PCR，可以對甲基化程度進行定量。



8、Multiplex-PCR：

多重PCR，指在一個PCR管中使用多對引物同時擴增超過一個的靶基因。同時分析單拷貝基因組的多個基因可避免分別擴增這些靶基造成對試劑和模板的浪費。使用多重PCR檢測引起遺傳疾病的基因突變時，可以同時擴增6個以上的靶點，也可同時檢測食品中多種病原菌的存在。在多重PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重連接探針擴增技術(shù))使用單對引物即可完成對多個靶基因的擴增，避免了多重PCR耗時的優(yōu)化步驟。



9、Nested PCR：

巢式PCR，通過使用兩套引物來進行兩次連續(xù)的反應(yīng)，用來增加DNA擴增的特異性。在第-一次反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物可能包含非特異性擴增產(chǎn)物，然后使用兩個新的、結(jié)合位點位于原引物內(nèi)部的引物進行第二次反應(yīng)。第二套引物的使用可提高反應(yīng)的特異性，增大單一產(chǎn)物產(chǎn)生的可能性。巢式PCR在提高特異性的同時，也增加了檢測的靈敏度。



10、Quantitative PCR(Q-PCR)：

定量PCR，用來測定樣本中的靶DNA的量。zui初的定量PCR主要是指Competitive PCR（競爭定量PCR）。競爭定量PCR：在反應(yīng)混合物中加入起始拷貝數(shù)已知的內(nèi)部對照，對照具有同靶序列相同的引物結(jié)合位點，但產(chǎn)生的產(chǎn)物長度與靶序列產(chǎn)生的產(chǎn)物長度不同，在PCR過程中對照與靶基因競爭相同的引物。反應(yīng)后通過比對對照和靶基因產(chǎn)生的產(chǎn)物量推斷初始靶基因的拷貝數(shù)，由于內(nèi)部對照和靶基因在擴增中的效率不一定相同，所以定量結(jié)果會產(chǎn)生偏差。



11、Allele-specific PCR：
等位基因特異性PCR，設(shè)計引物時選擇在基因組的多態(tài)性區(qū)域，使等位基因的突變定位在（或接近）引物的3'端，在嚴謹?shù)姆磻?yīng)條件下，存在錯配堿基的引物不能起始復(fù)制，而只有*匹配的引物才能起始復(fù)制，產(chǎn)生的產(chǎn)物因此顯示不同的基因型。
12、Touch down PCR

降落PCR，是另一種簡單的降低非特異性擴增的方法，可規(guī)避對PCR循環(huán)條件進行耗時的優(yōu)化實驗。降落PCR過程中，首輪循環(huán)的退火溫度設(shè)置在比引物的解鏈溫度高出幾度，使每個后續(xù)循環(huán)的退火溫度逐漸降到，直到退火溫度降到等于引物的解鏈溫度或比引物的解鏈溫度低幾度，后續(xù)的循環(huán)在此較低的退火溫度下完成，整個程序的退火溫度可降低10-15℃。在zui初幾個循環(huán)內(nèi)，高溫使引物的非特異性結(jié)合難以發(fā)生，只有同引物互補程度zui大的模板序列（很可能這一序列就是我們感興趣的序列）才能發(fā)生退火事件，因此保證靶序列得到優(yōu)先擴增。后續(xù)循環(huán)降低退火溫度可保證擴增效率，盡管zui終的退火溫度降低到足以使非特異性產(chǎn)物有效擴增的溫度，由于靶分子已經(jīng)開始指數(shù)期擴增，因此抑制非特異性產(chǎn)物的進一步形成。



13、Long PCR（Long distance PCR，Long range PCR）

長距離PCR，普通的Taq聚合酶一般只能擴增不超過3-5kb的片段，通過使用特定的聚合酶和緩沖液成分，來擴增較長的DNA鏈（10-40kb以上）。長距離PCR時經(jīng)常會在10-15個循環(huán)后，使每個循環(huán)的延伸時間都比上一循環(huán)的時間增加10秒左右，以補償聚合酶活性的損失。



14、Clony PCR

菌落PCR，通過PCR手段來迅速篩選陽性克隆子。使用滅菌的牙簽將菌落直接挑到反應(yīng)混合液中，通過PCR預(yù)變性步驟的高溫使細菌的基因組釋放作為PCR反應(yīng)的模板。菌落PCR中使用的引物定位在插入位點外側(cè)的載體區(qū)，因此盡管插入的序列各不相同，也不影響擴增反應(yīng)的進行。



15、RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends）

一種RT-PCR方法，當對DNA序列信息了解較少時，使用單個特異性引物加一個接頭引物來擴增cDNA的5'端（對應(yīng)轉(zhuǎn)錄的起始位點）或3'端從而產(chǎn)生新的cDNA，重疊的RACE產(chǎn)物可結(jié)合起來產(chǎn)生全長的cDNA-片段。



16、DD-PCR (differential display)：

差異顯示技術(shù)，用來鑒定不同組織中差異表達的基因。將不同組織的RT-PCR產(chǎn)物用短的、非特異性引物進行擴增，然后在凝膠上比對來源于不同組織的條帶，只在某種組織中才出現(xiàn)的條帶被認為是差異表達的。



17、AFLP（Amplified fragment length polymorphism）：

擴增片段長度多態(tài)性，通過擴增使不同生物基因組呈現(xiàn)不同長度的片段。



18、AP-PCR

(arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA)：

隨機擴增多態(tài)性DNA，使用隨機寡核苷酸片段來擴增序列未知的靶基因，形成基因組指紋圖譜，用來分析物種的相關(guān)性。



19、Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR：

可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列PCR，使引物定位在具有長度多態(tài)性的靶基因區(qū)，通過在凝膠電泳后對產(chǎn)物的大小進行分析來研究基因分型。



20、Inverse PCR：

反向PCR，允許擴增已知序列側(cè)翼的DNA區(qū)。首先將靶DNA用限制性內(nèi)切酶進行多輪消化，然后連接被消化的片段構(gòu)建環(huán)狀的分子，引物設(shè)計成可從序列已知的區(qū)域向外側(cè)延伸，結(jié)果擴增出環(huán)狀分子上剩余的序列。



21、Real-Time PCR：

實時PCR，由于通常的PCR在幾十個循環(huán)后都會進入平臺期，產(chǎn)物的量與初始模板量不在成正比，因此只能用來定性。而實時PCR通過使用熒光染料，例如SYBR Green或熒光標記探針，例如TaqMan可用來檢測隨著擴增的進行，產(chǎn)物量的變化而進行定量。



22、原位PCR

原位雜交細胞定位和PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)，使得靶基因檢測有了的改進。此技術(shù)是在細胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對靶基因片段進行擴增，通過摻入標記基團直接顯色或結(jié)合原位雜交進行檢測的方法。



23、RT-PCR（Reverse Transcription PCR）：

逆轉(zhuǎn)錄PCR，是用來擴增、分離和鑒定細胞或組織的信使RNA（mRNA）的技術(shù)。反應(yīng)由兩個階段組成：

1、使用逆轉(zhuǎn)錄酶，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)“RT”合成與RNA互補的cDNA（complementary DNA）

2、使用PCR擴增特異性的cDNA。

由于PCR的預(yù)變性步驟可以用來失活逆轉(zhuǎn)錄酶，所以兩個階段可在同一管內(nèi)完成。一些DNA聚合酶如Tth也有RT活性，因此可以單獨使用這種酶來完成兩步反應(yīng)。

RT-PCR可廣泛用于表達圖譜分析（用來確定基因的表達）；鑒定RNA轉(zhuǎn)錄子的序列，當相關(guān)的基因序列已知時，還可進一步知道基因組上外顯子和內(nèi)含子的位置；檢測病毒例如HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。