有關(guān)微生物的代謝說明

一、微生物的生長曲線及其應(yīng)用

微生物群體生長是指細(xì)胞數(shù)量的增加，是細(xì)胞生長和繁殖的結(jié)果?，F(xiàn)以單細(xì)胞的分裂方式進(jìn)行繁殖的細(xì)菌為對象考察其群體生長的規(guī)律。

將少量細(xì)菌接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下進(jìn)行培養(yǎng)時，它的生長具有一定的規(guī)律性。在其生長過程中，定時取樣計算細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量。然后以細(xì)菌細(xì)胞數(shù)的對數(shù)作縱坐標(biāo)，以生長時間作橫坐標(biāo)，繪制所得的曲線叫生長曲線。生長曲線代表了細(xì)菌在新的適宜的環(huán)境中生長繁殖至衰老死亡過程的動態(tài)變化。我們根據(jù)細(xì)菌生長繁殖速率的不同，將細(xì)菌的生長曲線大致分為下列四個時期。

1、延遲期：當(dāng)少量細(xì)菌接種到新鮮的液體培養(yǎng)基后，一般不立即進(jìn)行繁殖，生長速率等于零，這段時間稱為延遲期。處于延遲期的細(xì)菌細(xì)胞分裂遲緩、代謝活躍，細(xì)胞體積增長較快，但對不良的環(huán)境因素如高溫、低溫和高濃度的鹽溶液等比較敏感，容易死亡。

延遲期時間的長短，因細(xì)菌種類和培養(yǎng)條件從幾分鐘到幾小時不等，若用生命活動旺盛的細(xì)菌接種，且接種量大，則延遲期時間短。

2、穩(wěn)定期：在這一時期，活細(xì)胞數(shù)目達(dá)到zui高峰，但它的總數(shù)不會在增加。這是因為必要的營養(yǎng)物質(zhì)逐漸耗盡，同時某些有毒代謝產(chǎn)物在積累，以及其他外界因素都會使生長受到抑制，死亡率和繁殖率兩者達(dá)到平衡，活菌數(shù)保持相對穩(wěn)定，在曲線上保持平穩(wěn)。如果為了大量獲得菌體，就應(yīng)在此階段收獲。這一時期也是發(fā)酵過程積累代謝產(chǎn)物的主要階段。以上可以看出，穩(wěn)定期的微生物，在數(shù)量上達(dá)到了zui高水平，產(chǎn)物的積累也得到了zui高峰。穩(wěn)定期的長短與菌種和外界環(huán)境條件有關(guān)，生產(chǎn)上常常通過補(bǔ)料、調(diào)節(jié)PH值、調(diào)整溫度等措施來延長穩(wěn)定期，以積累更多的代謝產(chǎn)物。

3、對數(shù)期：在此期間，代謝活動zui強(qiáng)，組成新細(xì)胞物質(zhì)zui快，所有分裂形成的新細(xì)胞都生活旺盛。這一階段細(xì)菌數(shù)以幾何級數(shù)增加，所以稱為對數(shù)期。由于處于對數(shù)期的微生物的個體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致，代謝旺盛、生長迅速，所以是研究基本代謝的良好材料，也是發(fā)酵工業(yè)良好的種子。如果用作菌種，則延遲期很短，以至檢查不出延遲期?？稍诙虝r間內(nèi)獲得大量微生物以縮短發(fā)酵周期。

4、衰亡期：穩(wěn)定期后如再繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌死亡率逐漸增加，以致死亡率大大超過新生菌，菌體中活菌數(shù)急劇下降，出現(xiàn)了“負(fù)生長”。此時期為衰亡期

二、測定微生物群體數(shù)目的方法

1、計算器測定法：用特制的細(xì)菌計數(shù)器或血球計算器進(jìn)行計數(shù)。本方法很簡便，可以立即得出結(jié)果，但也有一些局限性，主要表現(xiàn)在活細(xì)胞不易區(qū)分。

2、平板菌落計數(shù)法：取一定容量的菌懸液，作一系列的倍比稀釋然后將定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)，算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，故此法又稱為活菌測定法。

3、稀釋法;將待測樣品作一系列稀釋，如10－1、10－2、10－3等，取1ml接種到新鮮培養(yǎng)基中，然后根據(jù)生長的稀釋度與出現(xiàn)生長的zui高稀釋度（即臨界級數(shù)），再用“或然率”理論，就可計算出樣品單位體積中細(xì)菌的近似值。

4、涂片染色法：將已知體積的待測微生物均勻的涂布在載波片的已知面積內(nèi)，經(jīng)固定染色后，在顯微鏡下借助目鏡測微尺測得視野的半徑和面積。得知其中視野菌的總數(shù)。然后從幾個視野的平均細(xì)胞數(shù)計算每毫升原液菌的細(xì)菌數(shù)。該法適用于細(xì)菌，酵母菌和霉菌的孢子全菌數(shù)量的測定，故常稱為全菌測定法。

5、濾膜法：該法主要用于生活飲用水細(xì)菌數(shù)的測定，一般用硝酸纖維制成濾膜，量取500ml水從濾膜上過濾，過濾后的濾膜培養(yǎng)一定的時間（24～48h）后取出，計算濾膜上的菌落數(shù)，根據(jù)菌落數(shù)即可計算出每毫升液體的菌體數(shù)。

三、測量微生物生長的方法

1、測定細(xì)胞物質(zhì)增長的方法

①干重法：取一定容量的培養(yǎng)物，用離心或過濾的方法，將菌體從培養(yǎng)基中分離出來，洗凈烘干、稱重，求出培養(yǎng)物中的菌體質(zhì)量，作為生長量的指標(biāo)。霉菌生長量的測定常用此法。

②含氮量測定法：此法只適用于細(xì)胞濃度較高的樣品，由于操作過程也較麻煩，故主要用于科學(xué)研究。

③比濁法：這是測定菌懸液中細(xì)胞數(shù)的快速方法。其原理是菌懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，與透光度成反比。此法簡便，但使用時須注意樣品顏色不宜太深，樣品中不要混雜其他物質(zhì)，同時菌懸液濃度必須在107個/ml以上才能顯示可信的混濁度。

一、微生物的酶

酶是由活的微生物體產(chǎn)生的、具有特殊催化能力的蛋白質(zhì)。它能在常溫、常壓下促進(jìn)微生物體內(nèi)一系列的分解代謝與合成代謝的各種反應(yīng)。

二、微生物的能量代謝

微生物所需能量的來源和外界的能源物質(zhì)如何變成微生物可利用的形式，以及如何被微生物利用等，都是微生物能量代謝的基本問題。

1、ATP的生成：ATP是腺嘌呤核苷三磷酸（腺三磷）的縮寫，是生物體中zui重要的高能磷酸化合物，通常以A—P～P—P表示。“A”為腺嘌呤，“P”為磷酸根，“～”代表高能鍵。

但ATP的生成過程需要供應(yīng)能量，能量來自光能或者化學(xué)能，以光能生成ATP的過程稱為光能磷酸化作用，以化學(xué)能生產(chǎn)ATP的過程稱為氧化磷酸化作用。

微生物的氧化作用可根據(jù)zui終電子受體的性質(zhì)，分為有氧呼吸作用、無氧呼吸作用和發(fā)酵作用三種。

上述三種生物氧化的方式，獲得能量的水平不同，如以葡萄糖作為氧化的底物時，它們放出能量的反應(yīng)見下表：

不同氧化方式的放能反應(yīng)

氧化過程中所釋放出的大部分能量，只有通過磷酸化作用轉(zhuǎn)移至ATP中，才能成為生物可利用的能量。

2、微生物的呼吸類型：根據(jù)微生物與分子態(tài)氧的關(guān)系，即微生物在生活中是否需要氧，可將微生物分為以下幾個類型。

1）好氧性微生物：凡是生活中需要氧的微生物稱為好氧性微生物或好氣性微生物。大多數(shù)是細(xì)菌、所有的放線菌和霉菌都屬于此類型。在自然界中，好氧性微生物的種類和數(shù)量都是zui多的。

2）微好氧性微生物：只需要在微量氧的條件下生活的微生物稱為微好氧性微生物，如固氮螺菌。

3）厭氧性微生物：凡生活中不需要氧的微生物稱為厭氧性微生物。某些細(xì)菌，如某些梭狀芽孢桿菌。

4）兼性厭氧性微生物：凡在有氧或無氧的條件下都能生活的微生物稱為兼性厭氧性微生物。它們可在有氧或無氧的情況下以不同的氧化方式產(chǎn)生能量，有兩種類型：

①在有氧的條件下進(jìn)行有氧呼吸，在無氧的條件下進(jìn)行無氧呼吸。如反硝化細(xì)菌，在有氧時，以氧作為zui終電子受體進(jìn)行有氧呼吸，在無氧時，以無機(jī)物NO₃－中的氧作為電子受體進(jìn)行無氧呼吸。

②在有氧的條件下進(jìn)行有氧呼吸作用，在無氧的條件下進(jìn)行發(fā)酵作用，如酵母菌，在有氧時進(jìn)行有氧呼吸，產(chǎn)生CO₂和H₂O，基質(zhì)被*氧化，釋放較多能量，而在無氧條件下則進(jìn)行發(fā)酵作用，產(chǎn)生CO₂和C₂H₅OH，即酒精發(fā)酵。

3、微生物的物質(zhì)代謝及其產(chǎn)物

蛋白質(zhì)的代謝：蛋白質(zhì)是微生物的有機(jī)氮源。但大部分微生物不能利用純粹的蛋白質(zhì)，因為蛋白質(zhì)不能透過細(xì)胞膜。必須由胞外酶把它分解成簡單的產(chǎn)物，如Aa等，然后才能被微生物吸收而利用來構(gòu)成菌體本身的成分。細(xì)菌分解蛋白質(zhì)的能力如液化明膠和酪蛋白的胨化等，可用于鑒別細(xì)菌。此外，有些細(xì)菌在分解Aa時，還可以產(chǎn)生一些特殊的產(chǎn)物，根據(jù)這些產(chǎn)物可以用作細(xì)菌的鑒別。例如，大腸桿菌可以分解色氨酸產(chǎn)生吲哚。有些細(xì)菌如變形桿菌能分解胱氨酸等氨基酸而產(chǎn)生H₂S。通常在培養(yǎng)基中加入醋酸鉛，H₂S遇醋酸鉛，變成棕黃色或黑色的硫化鉛。這種方法也常用來作微生物分解Aa的生理生化鑒定。

糖的代謝：糖的種類很多，多數(shù)糖能被微生物利用。而微生物能否利用某些糖類，主要決定于微生物所具有的酶系統(tǒng)的性質(zhì)。糖在有充分氧的環(huán)境中，被微生物利用時一般可以*分解為CO₂和H₂O，而無中間產(chǎn)物的積累。糖在缺氧的條件下被微生物利用時，可形成多種不*的代謝產(chǎn)物如C₂H₅OH、乳酸等。無論是在有氧或缺氧的條件下，微生物利用糖類所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是多種多樣的。因此，可根據(jù)不同微生物在一定條件下進(jìn)行糖代謝過程中所具有的代謝產(chǎn)物的特點(diǎn)，來鑒別微生物。

脂類代謝：雖然微生物也能利用脂類，但從量上來看，脂類不是微生物的主要養(yǎng)料。有些細(xì)菌能分泌脂肪酶，可以把脂肪分解為甘油及脂肪酸。甘油的分解代謝按照糖的代謝方式進(jìn)行。而脂肪酸則是通過β氧化作用進(jìn)入三羧酸循環(huán)的過程進(jìn)行分解，zui終被分解為CO₂和H₂O

4、微生物的特殊代謝產(chǎn)物

①毒素：微生物在物質(zhì)代謝過程中，能產(chǎn)生對人或動物有毒害的物質(zhì)，稱為毒素。微生物所產(chǎn)生的毒素可分為內(nèi)毒素和外毒素兩大類。

內(nèi)毒素存在于細(xì)菌體內(nèi)，不分泌到菌體外，只能在菌體裂解時，毒素才能被釋放出來。

外毒素是由菌體內(nèi)向菌體外分泌出來的一種有毒物質(zhì)，毒力較強(qiáng)。

②抗菌素：有些微生物在代謝過程中可產(chǎn)生具有抑制或殺死它種微生物的物質(zhì)，這種物質(zhì)稱為抗菌素，例如點(diǎn)青霉和產(chǎn)黃青霉產(chǎn)生青霉素。

一、原理

大多數(shù)微生物均可用人工方法培養(yǎng)。以人工方法配制成的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，稱為培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應(yīng)具有適宜的ph值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。

二、培養(yǎng)基的種類

培養(yǎng)基按物理狀態(tài)分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基；按組成成分分為天然、合成和半合成培養(yǎng)基；按其作用分為基礎(chǔ)、加富、選擇、鑒別、厭氧和活體培養(yǎng)基等。

1、基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有微生物所需要的基本營養(yǎng)成分，如肉湯培養(yǎng)基。

2、加富培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中再加入葡萄糖。血液、血清或酵母浸膏等物質(zhì)，可供營養(yǎng)要求較高的微生物生長，如血平板、血清肉湯等。

3、活體培養(yǎng)基：有一些微生物可以在活的動植物體或離體的活組織細(xì)胞內(nèi)生長繁殖，因此，某些活的動植物體或離體的活組織細(xì)胞對這些微生物來說，是很好的培養(yǎng)基。

4、選擇培養(yǎng)基：是根據(jù)某一種或某一類微生物的特殊營養(yǎng)要求或?qū)σ恍┪锢?。化學(xué)條件的抗性而設(shè)計的培養(yǎng)基。利用這種培養(yǎng)基可以把所需要的微生物從混雜的其他微生物中分離出來。

5、鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種試劑或化學(xué)藥品，使培養(yǎng)后發(fā)生某種化學(xué)變化，從而鑒別不同類型的微生物。如伊紅－美藍(lán)（EMB）培養(yǎng)基、糖發(fā)酵管、醋酸鉛培養(yǎng)基等。

6、厭氧培養(yǎng)基：專性厭氧菌不能在有氧的條件下生長，所以必須將培養(yǎng)基與環(huán)境中的空氣隔絕，或降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位，如在液體培養(yǎng)基的表面加蓋凡士林或醋，或在液體培養(yǎng)基中加入碎肉快制成庖肉培養(yǎng)基等。此外，也可以利用物理或化學(xué)的方法除去培養(yǎng)環(huán)境中的氧，以保證厭氧環(huán)境。

三、培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基的制備過程可表示為：

稱量藥品→溶解→調(diào)節(jié)PH值→溶化瓊脂→過濾分裝→包扎標(biāo)記→滅菌→擺斜面或倒平板。

1、稱量藥品;根據(jù)培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各種藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。

2、溶解：用量筒取一定量（約占總量的1/2）蒸餾水倒入盛有藥品的燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻璃棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品*溶解后，停止加熱，補(bǔ)足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其他原料，待*溶化后，補(bǔ)足水分。

3、調(diào)節(jié)PH值：根據(jù)培養(yǎng)基對PH值的要求，用50g/LNaOH或5%（體積分?jǐn)?shù)）HCl溶液調(diào)至所需的PH值。測定PH值可用PH試紙或酸度計等。

4、溶化瓊脂：固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量的瓊脂，將盛有培養(yǎng)基的器皿置于電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂*溶化后才能停止攪拌，并補(bǔ)足水分（水需預(yù)熱）。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

5、過濾分裝：先將過濾分裝裝置安裝好。如果是液體培養(yǎng)基，玻璃漏斗中放一層濾紙；如果是固體或半固體培養(yǎng)基，則須在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進(jìn)行過濾。過濾后立即進(jìn)行分裝。分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾染在瓶口或管口，以免浸濕棉塞，引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝量為管高的1/5，半固體分裝量一般以試管高度的1/3為宜，分裝三角瓶，以不超過三角瓶容積的一半為宜。

6、包扎標(biāo)記：培養(yǎng)基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、制備組別和實驗者姓名、日期等。

7、滅菌：上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃，20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成分。如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面。斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。

四、培養(yǎng)基的主要成分

1、營養(yǎng)物質(zhì)：有蛋白胨、肉浸汁和牛肉-膏、糖（醇）類、血液、雞蛋與動物血清、生長因子、無機(jī)鹽類。

2、水分：制備培養(yǎng)基常用蒸餾水（因蒸餾水中不含雜質(zhì)），也可用自來水、井水等，但需先經(jīng)煮沸，使部分鹽類沉淀，再經(jīng)過濾方可使用。

3、凝固物質(zhì)：配制固體培養(yǎng)基的凝固物質(zhì)有瓊脂、明膠和卵白蛋白及血清等。瓊脂是從石花菜海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應(yīng)用zui-廣的凝固劑。其化學(xué)成分主要是多糖，加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下溶化，于45℃以下凝固。但多次反復(fù)溶化，其凝固性降低。瓊脂本身對細(xì)菌無營養(yǎng)價值，自然界中僅有極少數(shù)的細(xì)菌能分解它。

根據(jù)瓊脂含量的多少，可配制成不同性狀的培養(yǎng)基。另外，由于各種牌號瓊脂的凝固能力不同，以及當(dāng)時氣溫的不同，配制時用量應(yīng)酌情增減，夏季可適當(dāng)多加。

4、抑制劑：在制備某些培養(yǎng)基時需加入一定的抑制劑，來抑制非檢出菌的生長或使其少生長，以利于檢出菌的生長。抑制劑種類很多，常用的有膽鹽、煌綠、玫瑰紅酸、亞硫酸鈉、某些染料及抗菌素等。這些物質(zhì)具有選擇性抗菌作用。

5、指示劑：為便于了解和觀察細(xì)菌是否利用和分解糖類等物質(zhì)，常在某些培養(yǎng)基中加入一定種類的指示劑，如酸堿指示劑、氧化還原指示劑等。