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醋酸纖維素薄膜電泳實(shí)驗(yàn)會(huì)遇到的問(wèn)題
1. 電泳圖譜不齊或分離不良
這是電泳分析中常見的問(wèn)題,多數(shù)是由于血清滴加不均勻或滴加過(guò)多,也有因薄膜質(zhì)量不合要求所致。點(diǎn)樣這一步非常關(guān)鍵,一定要按操作步驟進(jìn)行。首先選擇質(zhì)勻、孔細(xì)、染料吸附少的薄膜充分浸透緩沖液至濕度均勻無(wú)干白點(diǎn)。然后將濾紙吸去薄膜表面的多余水份,使薄膜含水量飽和均勻,這樣才能防止薄膜表面液體含量不均,水份移動(dòng)而引起標(biāo)本移位。
點(diǎn)樣前注意關(guān)閉門窗和風(fēng)扇,因空氣流通快可使標(biāo)本和水份蒸發(fā)而影響電泳圖形。點(diǎn)樣要力求做到均勻迅速,有報(bào)道,在實(shí)踐中把加樣器干沾血清,改為沾取標(biāo)本前先浸入蒸餾水中沾濕用吸水紙吸干后再沾血清,這樣加樣器內(nèi)均勻沾取血清的效果較干沾為佳。
2. 電泳圖譜出現(xiàn)條痕
問(wèn)題是由于點(diǎn)樣后薄膜過(guò)干,或因電泳槽密閉性不良,或電流過(guò)大,溫度升高,薄膜水份蒸發(fā)干燥而造成的。因此薄膜一定要充分浸透后才能點(diǎn)樣,并注意檢查電泳槽是否蓋緊,電泳槽要放在遠(yuǎn)離光源熱源的陰涼之處。
在電泳過(guò)程中隨時(shí)觀察電壓電流的變化,因通電后產(chǎn)生一定的熱量,電流會(huì)有所增加??刂齐妷?00~110 V,電流0.5~0.6 mA/cm,電泳時(shí)間一般冬長(zhǎng)夏短,以區(qū)帶展開3.5~4 cm 即可(另加一條溴酚藍(lán)預(yù)染血清,同樣操作,指示區(qū)帶展開的距離)。
3. 區(qū)帶拖尾或區(qū)帶過(guò)于緊密
緩沖液的離子強(qiáng)度低于0.05即出現(xiàn)區(qū)帶拖尾現(xiàn)象,離子強(qiáng)度>0.075則區(qū)帶過(guò)于緊密。此時(shí)需要檢查更換緩沖液。常規(guī)操作一般使用連續(xù)電泳鹽緩沖液pH8.6,離子強(qiáng)度0.06。電泳槽中緩沖液經(jīng)10次使用后,不應(yīng)簡(jiǎn)單地采取交換電極的方法,而是將緩沖液取出重新混合過(guò)濾后,再進(jìn)行使用,一般用4個(gè)周期后需更換新液。
4. 區(qū)帶一邊長(zhǎng)一邊短呈現(xiàn)扭曲現(xiàn)象
這是薄膜兩邊電阻不一樣,電阻大的一邊電流小,速度慢,區(qū)帶展開短。造成這種現(xiàn)象的原因是薄膜未緊壓在電泳槽的濾紙橋上,使薄膜接觸不良而增大了電阻。在操作過(guò)程中,一定要注意使薄膜兩端緊壓在濾紙橋上。
5. γ球蛋白區(qū)帶倒退
這是電滲作用引起的??缮唿c(diǎn)樣端的緩沖液面高度或適當(dāng)加大電流量克服之。
6. 染色后白蛋白中間色淺
有些同學(xué)在實(shí)驗(yàn)中往往急于求成,染色時(shí)間未到便匆忙取出薄膜漂洗,結(jié)果造成了白蛋白區(qū)帶中間色淺的現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的另一個(gè)原因是白蛋白含量過(guò)高??稍黾尤旧珪r(shí)間或減少點(diǎn)樣量解決之。
7. 染色后區(qū)帶清晰度不良
陳舊標(biāo)本可使區(qū)帶分離清晰度大為降低。應(yīng)盡量當(dāng)日標(biāo)本當(dāng)日做,不超過(guò)2天。另外標(biāo)本不可溶血,因溶血標(biāo)本中血紅蛋白與β球蛋白的電泳區(qū)帶相重迭。可造成β球蛋白含量升高而蛋白質(zhì)含量相對(duì)減少的結(jié)果。
8. 白蛋白區(qū)帶染色不均并有空泡
這是染色液陳舊所致,染色液存放和使用過(guò)久,會(huì)降低蛋白質(zhì)結(jié)合染料的能力。發(fā)現(xiàn)正在使用的染液已陳舊時(shí),應(yīng)立即全部棄去,更換新液。
9. 透明時(shí)膜發(fā)白不能*透明
薄膜未干或透明液中醋酸含量不足可造成膜發(fā)白而不能達(dá)到透明的目的,應(yīng)將薄膜晾干,適當(dāng)增加透明液的醋酸濃度。
10. 透明時(shí)膜溶解
室內(nèi)溫度過(guò)高或透明液醋酸濃度過(guò)高均可使膜溶解。可采用適當(dāng)降低透明液醋酸濃度的辦法來(lái)解決。
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