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苯甲脒瓊脂糖凝膠4FF使用小技巧
苯甲脒類物質(zhì)是絲氨酸蛋白酶的廣譜抑制劑,所以將這類物質(zhì)偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠4FF上,可以從各種來源的樣品中一步純化胰蛋白酶、凝血酶、尿激酶、激肽釋放酶、前激肽釋放酶等絲氨酸蛋白酶。
苯甲脒-瓊脂糖凝膠 4FF 對于不同的樣品的親和力不同,吸附載量取決于流速、pH、緩沖液組成和溫度等參數(shù)。
(1)讓所有的材料和試劑達(dá)到室溫。配制初始緩沖液(平衡液)和洗脫緩沖液。
(2)根據(jù)柱子大小取所需量的凝膠,用去離子水清洗掉 20%乙醇,用初始緩沖液(按凝膠:緩沖液=3:1 的比例)配成勻漿。
(3)將柱內(nèi)及柱子底端用水或緩沖液潤濕并保持一小段液位,務(wù)必使底端無氣泡。
(4)用玻璃棒引導(dǎo)勻漿沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi),注意勿使產(chǎn)生氣泡。打開柱子出液口,使凝膠在柱內(nèi)自由沉降,連結(jié)好柱子頂端柱頭。
(5)打開蠕動泵,讓緩沖液用使用時(shí)流速的 1.33 倍的流速流過,使柱床穩(wěn)定(注意壓力不要超過填
樣品應(yīng)*溶解,并且pH值應(yīng)與結(jié)合緩沖液pH值相同。
為了避免堵塞層析柱,我們建議通過0.45μ m過濾器進(jìn)行離心和過濾,以去除細(xì)胞碎片或其他顆粒物質(zhì)。
平衡色譜柱
用5-10個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液平衡該柱,直到流出液電導(dǎo)和pH不變。 參考結(jié)合緩沖液:0.05M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH 7.4。
上樣
(1)樣品用平衡液配制,樣品一定要離心或過濾后上樣。鹽濃度太大的樣品需要處理后再配。
(2)一般情況是讓目標(biāo)產(chǎn)品結(jié)合在柱子上,用平衡液洗去雜質(zhì)和沒有結(jié)合的蛋白,再選擇一種洗脫洗下目標(biāo)產(chǎn)品
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