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Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)注意這幾點(diǎn)

更新時(shí)間:2022-01-13      瀏覽次數(shù):415

Western Blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)注意這幾點(diǎn)


1、收集蛋白樣品(Protein sample preparation)


可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖毫呀赓N壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白,例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋白、線粒體蛋白等,可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白,也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提。


收集完蛋白樣品后,為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致,需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同,需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用北京博奧森生物技術(shù)公司生產(chǎn)的WIP細(xì)胞裂解液,可以使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒。


2、電泳(Electrophoresis)


(1)、SDS-PAGE凝膠配制


SDS-PAGE凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制,也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度SDS-PAGE的配方。


(2)、樣品處理


在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積,在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。5X的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制,也可以使用博奧森生產(chǎn)的SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X) 。100℃或沸水浴加熱3-5分鐘,以充分變性蛋白。


(3)、上樣與電泳


冷卻到室溫后,把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果,以及判斷蛋白分子量大小,最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。


實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、 把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上;


a. 轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜,將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上,用5ml移液管在凝膠上來(lái)回滾動(dòng)去除所有的氣泡


b. 在凝膠/濾膜外再包一張3mm濾紙(預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕),將凝膠夾在中間,保持濕潤(rùn)和沒(méi)有氣泡


c. 將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中,凝膠面向陰極


d. 將上述裝置放入緩沖液槽中,并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒(méi)凝膠


e. 按照廠家所示接通電源開(kāi)始電泳轉(zhuǎn)移


f. 轉(zhuǎn)移結(jié)束后,取出薄膜和凝膠,棄去凝膠


2、 將薄膜漂在氨基黑中快速染色,直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出,記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置;


3、 用100ml水洗滌纖維素膜,必要時(shí)可用脫色緩沖液;


4、 膜置印跡緩沖液中于37℃保溫1小時(shí);


5、 室溫下,用PBS-Tween緩沖液洗滌薄膜


6、 用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中,盡可能不留空氣;


7、 袋的一角剪一緩沖液的小口,用透析袋夾緊;




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