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大鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)酶聯(lián)免疫試劑盒實驗原理
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中大鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平。用純化的大鼠環(huán)
磷酸腺苷(cAMP)抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被單抗的微孔中依次加入環(huán)磷酸腺
苷(cAMP),再與HRP 標記的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)抗體結(jié)合,形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物,
經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下
轉(zhuǎn)化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的環(huán)磷酸腺苷(cAMP)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm
波長下測定吸光度(OD 值),通過標準曲線計算樣品中大鼠環(huán)磷酸腺苷(cAMP)濃度。
標本要求
1.標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能
馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2.不能檢測含NaN3 的樣品,因NaN3 抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。
操作步驟
1. 標準品的稀釋:本試劑盒提供原倍標準品一支,用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀
釋。
600pg/ml 5 號標準品150μl 的原倍標準品加入150μl 標準品稀釋液
300pg/ml 4 號標準品150μl 的5 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
150pg/ml 3 號標準品150μl 的4 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
75pg/ml 2 號標準品150μl 的3 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
37.5pg/ml 1 號標準品150μl 的2 號標準品加入150μl 標準品稀釋液
2. 加樣:分別設(shè)空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、標準孔、
待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl,待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,
然后再加待測樣品10μl(樣品*終稀釋度為5 倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡
量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。
3. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘。
4. 配液:將20 倍濃縮洗滌液用蒸餾水20 倍稀釋后備用
5. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 秒后棄去,如此
重復(fù)5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶標試劑50μl,空白孔除外。
7. 溫育:操作同3。
8. 洗滌:操作同5。
9. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色
15 分鐘.
10. 終止:每孔加終止液50μl,終止反應(yīng)(此時藍色立轉(zhuǎn)黃色)。
11. 測定:以空白空調(diào)零,450nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。測定應(yīng)在加終止
液后15 分鐘以內(nèi)進行。
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