標題：HRP標記兔抗人IgA

產品概述

HRP標記兔抗人IgA

本產品僅用于研究用途，不用于人類、治療或診斷應用。

辣根過氧化物酶(HRP)標記

(HRP)標記單抗和多克隆抗體的常用方法是過碘酸鈉法。其原理是HRP的糖基用過碘酸鈉氧化成醛基,加入抗體lgG后該醛基與lgG氨基結合,形成Sch氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合,在用過碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應末了,用朋氫化鈉穩(wěn)定Schf氏堿。這里介紹兩種程序。

程序一

(1)將5 mg HRP溶于0.5m0.1 mol/L NaHCO3溶液中 加 0.5ml  10mmoLNaO4溶液,混勻,蓋緊瓶塞,室溫避光作用2小時。

(2)加075m0. mol/L Na2CO3混勻。

(3)加入0.75m小風已處理的腹水,或純化單抗等(15mgm),混勻。

(4)稱取 Sephadex  G25干粉0.3g 加入一支下口墊玻璃棉的5m注射器外筒內;隨后籽上述交聯(lián)物移入注射器外套;蓋緊,室溫作用(避光)3小時或4°C過夜。

HRP標記兔抗人IgA
(5)用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出,收集洗出液,加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml

NaBH4溶液,混勻,室溫作用30分鐘;再加入320 V NaBH4溶液,混勻,室溫作用1小時或4過夜)

(6)將交聯(lián)物過 Sephadex g200或 Sepharose6B(2.6×50cm層析純化,分管收集第Ⅰ 峰。(7)酶結合物質量鑒定

克分子比值測定 酶量(mg/m)=OD403  ×0.4

IgG量(mg/m)=(OD280OD403×0.3)×062克分子比值(EP=酶量×4/gG量,一般在12之間。

酶結合率=酶量x體積/抗體,標記率一般為03-0.6,即1-2個HRP分子結合在一個抗體分子,標記率可大于06,080.90D4030D280等于04時,EP約為1

標記率=OD4030D280

酶活性和抗體活性的測定可應用E凵SA法、免疫擴散

DABH2O2顯色反應測定酶結合物的酶活性,抗體活性及效

 價、特異性。

(8)HRP抗體結合物的保存:加入等量甘油后,小量分裝-20°℃存放,防止反復凍融;或加入等量60%甘油4℃保存;不宜加NaN3或酚防腐,否則會影響酶活性。必要時凍干保存,以BSA或脫脂牛奶作保護劑。

程序二:

(1)將5 mg HRP溶于0.3 mol/L PH8.1NaHCO3溶液中,加入1%二硝基氟苯無水乙醇溶液0.1ml室溫攪拌作用1小時,以封閉HRP分子上的a和ε氨基。(2)再加1ml 0.06moL過碘酸鈉溶液,在室溫中避光輕攪30分鐘,溶液呈黃綠色:隨后加1ml 0.06moL 乙二醇，輕攪1小時，中止氧化反應。

(3)移入透析袋中，在1000ml 0.01mol/LPH9.5碳酸鹽緩沖液中，4°C透析過夜，更換三次緩沖液，
注意避光。
(4)吸取上述醛化好的HRP溶液3ml,加入5mgIgG的碳酸鹽緩沖液1ml,室溫輕攪2-3小時，避光;加入5mg NaBH4 4°C放置3小時或過夜，或換用乙醇胺(2mol/L
PH9.5)0.2ml，作用| 7小時。(5)再移入透析袋中，在0.02mol/L PH7.4 PBS中透析
24小時，更換三次緩沖液。 

單體IgA占血清免疫球蛋白的5-15%，而二聚IgA則局限于粘膜表面，如唾液、胃腸道分泌物、支氣管液和牛奶。粘膜IgA通過中和粘膜表面的感染因子，在宿主防御中發(fā)揮重要作用。這種產生通常是局部的，抗原特異性IgA產生的B細胞可以在固有層下的區(qū)域找到，在那里成熟為產生二聚IgA的漿細胞。IgA缺乏是常見的免疫缺陷，可能影響血清和粘膜產生的IgA。