菌種保藏的基本操作方法

菌種在生命活動(dòng)、菌種繁育時(shí)，由于受外界不良條件、病毒的傷害，往往會(huì)發(fā)生退化。如高溫會(huì)使菌絲生命力降低；傳代次數(shù)增加，會(huì)使某些細(xì)胞器減少甚至丟失；接種時(shí)菌種常會(huì)受到消du要?jiǎng)┖突鹧娓邷氐膫Χl(fā)生退化；接種挑選菌種時(shí)可能在無意中造成某一形態(tài)的菌絲比例多，而另一形態(tài)的菌絲減少；傳代，繁殖菌種很可能被病毒侵染。如此種種情況，都會(huì)使菌種發(fā)生退化。保種可降低發(fā)生變異的頻率。保種另一層意義是，保藏某一菌種的某些特殊遺傳性狀（遺傳基因），這此性狀對生產(chǎn)可能無經(jīng)濟(jì)使用價(jià)值，但以后或才可作為育種材料。

1.定期移植法 

將菌種接種于所要求的培養(yǎng)基上﹐在適合溫度中培養(yǎng)﹐至靜止期或產(chǎn)生成熟的孢子時(shí)﹐置入 5℃的冰箱(或冰庫)保存。在培養(yǎng)和保存的過程中﹐由于代謝產(chǎn)物的累積而改變了原菌的生活條件﹐結(jié)果菌落群體中的個(gè)體就不斷衰老和死亡﹐因此每5~15天或 1~4個(gè)月重新移植一次﹐具體間隔時(shí)間因種而異。凡能人工培養(yǎng)的微生物都可用此法保存。此法不需特殊設(shè)備﹐但煩瑣﹐費(fèi)時(shí)﹐而且經(jīng)常移植容易引起菌種退化。 

2.礦油封藏法 

將化學(xué)純的液體石蠟(礦油)經(jīng)高壓蒸氣滅菌﹐放在40℃恒溫箱中蒸發(fā)其中的水分﹐然后注入斜面培養(yǎng)物中﹐使液面高出斜面約 1厘米。將試管直立﹐放在15~20℃室溫中保存。由于在斜面培養(yǎng)物上覆蓋一層液體﹐既能隔絕空氣﹐又能防止培養(yǎng)基因水分蒸發(fā)而干燥﹐可以延長菌種保藏的時(shí)間。但注入的液體必須不與培養(yǎng)基混溶﹑對菌種無毒﹐不易被利用和揮發(fā)。此法適用于酵母菌﹑芽孢桿菌﹔不適用于固氮菌﹑乳酸桿菌﹑明串珠菌﹑法門氏菌和毛霉目中的大多數(shù)屬種。此法簡便易行﹐但必須注意防火和污染。 

3.沙土管法 

將沙或土過篩﹑烘干﹑裝管﹑滅菌﹑然后將菌種制成孢子懸液滴入其中混勻﹐放到盛氯化鈣的干燥器里吸除水分﹐干燥后保存或用火焰封管后保存。吸附在干燥沙土上的孢子因缺水而處于休眠狀態(tài)﹐可保存較長時(shí)期。此法適用于芽孢桿菌﹑梭狀芽孢桿菌﹑放線菌﹑鐮刀菌等。 

4.麩皮法 

將麩皮制成培養(yǎng)基﹐培養(yǎng)要保存的菌種﹐待生長良好后﹐置干燥器中保存。這是根據(jù)中國釀造酒﹑醋﹑醬時(shí)制曲的經(jīng)驗(yàn)所采用的一種保藏方法﹐適用于谷物微生物區(qū)系中的種類。 

5.L-干燥法 

又稱液體干燥法或真空干燥法﹐用含3%谷氨酸鈉的0.1M磷酸緩沖溶液 (pH7.0)做分散媒﹐將待保藏的微生物制成高濃度的細(xì)胞懸液﹐滴入無菌安瓿瓶中﹐每管0.05毫升﹔將安瓿瓶固定在多歧管上﹐并以水浴保持安瓿瓶內(nèi)樣品溫度為10℃﹐在 13.3~1.3帕的真空度下干燥﹐火焰封管保存。此法不經(jīng)凍結(jié)﹐用真實(shí)泵迅速抽乾﹐可避免菌種的凍傷或死亡。廣泛應(yīng)用于病毒﹑噬菌體﹑細(xì)菌﹑酵母菌﹑藍(lán)藻﹑原生動(dòng)物等。 

6.梭氏法 

將容有1滴細(xì)胞懸液的小管﹐置于盛有氫氧化鉀或五氧化二磷吸水劑的大試管中﹐用真空泵抽至1.3帕?xí)r﹐將大試管密封保存。這是為減少細(xì)胞死亡率而采取的一種不經(jīng)凍結(jié)﹑緩慢脫水的干燥保藏法﹐適用于多種細(xì)菌﹑真菌。 

7.冷凍真空干燥法 

將細(xì)胞懸液每0.1~0.2毫升注入一無菌安瓿瓶﹐于-40℃預(yù)凍1小時(shí)﹐再于-20~30℃﹑真空度為13.3帕的條件下脫水。在脫水過程后期﹐安瓿瓶外溫度可逐漸升至25℃。脫水后的樣品含水量應(yīng)在 3%以下。將安瓿瓶保持真空度 1.3帕﹐用火焰溶封﹐置10℃保存。為防止細(xì)胞在凍結(jié)和脫水過程中損傷或死亡﹐要用保護(hù)劑制備細(xì)胞懸液。保護(hù)劑有脫脂牛奶﹑血清﹑10%蔗糖或葡萄糖溶液等﹐其作用是通過氧和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親合力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。此法適用于病毒﹑衣原體﹑枝原體﹑細(xì)菌﹑放線菌﹑酵母菌﹑絲狀真菌等的保存﹐是當(dāng)前保藏菌種的一個(gè)重要方法。但是﹐鹽桿菌﹑發(fā)光桿菌﹑黏桿菌﹑阿舒囊霉﹑多囊霉﹑擔(dān)子菌中的大多數(shù)屬種不適用于此法保存。